دانشکده کشاورزي
پايان نامه کارشناسي ارشد

کلونينگ و بيان بخش‌هاي آنتي ژنيک سيتوتوکسين مرتبط با ژن A (CagA) هليکو باکتر پيلوري در باکتري اشرشيا کلي و امکان سنجي توليد IgY در زرده تخم مرغ

مهديه مالکي

استاد راهنما
دکتر محمد رضا نصيري

استادان مشاور
دکتر مجتبي طهمورث پور
دکتر کيارش قزويني
شهريور 1393

دانشکده کشاورزي
گروه علوم دامي
پايان نامه کارشناسي ارشد

کلونينگ و بيان بخش‌هاي آنتي ژنيک سيتوتوکسين مرتبط با ژن A (CagA) هليکو باکتر پيلوري در باکتري اشرشيا کلي و امکان سنجي توليد IgY در زرده تخم مرغ

مهديه مالکي

شهريور 1393

تعهد نامه
عنوان پايان نامه:
کلونينگ و بيان بخش‌هاي آنتي ژنيک سيتوتوکسين مرتبط با ژن A (CagA) هليکو باکتر پيلوري در باکتري اشرشيا کلي و امکان سنجي توليد IgY در زرده تخم مرغ
اينجانب مهديه مالکي دانشجوي دوره کارشناسي ارشد رشته ژنتيک و اصلاح دام دانشکده کشاورزي دانشگاه فردوسي مشهد تحت راهنمايي جناب آقاي دکتر محمدرضا نصيري متعهد مي‌شوم:
– نتايج ارائه شده در اين پايان‌نامه حاصل مطالعات علمي و عملي اينجانب بوده، مسئوليت صحت و اصالت مطالب مندرج را به طور کامل بر عهده مي‌گيرم.
– در خصوص استفاده از نتايج پژوهشهاي محققان ديگر به مرجع مورد نظر استناد شده است.
– مطالب مندرج در اين پايان نامه را اينجانب يا فرد يگري به منظور اخذ هيچ نوع مدرک يا امتيازي تاکنون به هيچ مرجعي تسليم نکرده است.
– کليه حقوق معنوي اين اثر به دانشگاه فردوسي مشهد تعلق دارد. مقالات مستخرج از پايان‌نامه، ذيل نام دانشگاه فردوسي مشهد (Ferdowsi University of Mashhad) به چاپ خواهد رسيد.
– حقوق معنوي تمام افرادي که در به دست آمدن نتايج اصلي پايان‌نامه تاثير‌گذار بوده‌اند در مقالات مستخرج از رساله رعايت خواهد شد.
– در خصوص استفاده از موجودات زنده يا بافتهاي آنها براي انجام پايان‌نامه، کليه ضوابط و اصول اخلاقي مربوطه رعايت شده است. تاريخ
مهديه مالکي

مالکيت نتايج و حق نشر
* کليه حقوق معنوي اين اثر و محصولات آن (مقالات مستخرج، برنامه‌هاي رايانه‌اي، نرم‌افزارها و تجهيزات ساخته شده) به دانشگاه فردوسي مشهد تعلق دارد و بدون اخذ اجازه کتبي از دانشگاه قابل واگذاري به شخص ثالث نيست.
استفاده از اطلاعات و نتايج اين پايان نامه بدون ذکر مرجع مجاز نيست
چکيده
هليکوباکتر پيلوري شايع ترين پاتوژن گوارشي است که نيمي از مردم دنيا را آلوده ساخته و مهمترين علت بيماري‌هاي معده اي-روده اي از جمله گاستريک مزمن، زخم معده و دوازدهه، سرطان معده و لنفوما است. ژن CagA (سيتوتوکسين مرتبط با ژن A) يکي مهمترين شاخص‌هاي بيماري زاي اين باکتري است. در اين مطالعه به منظور همانه سازي بخش‌هاي آنتي ژنيک ژن CagA و بررسي توليد IgY در زرده تخم مرغ در ابتدا بر اساس برنامه‌هاي بيوانفورماتيکي قطعه حاوي اپي‌توپ‌هاي اصلي ژن CagA به طول 996 جفت باز شناسائي شد سپس اين قطعه به کمک PCR از ژنوم هليکوباکتر پيلوري موجود در بيوپسي معده 30 بيمار مبتلا به اين باکتري جدا شده و با استفاده از هضم آنزيمي به ناقل pET32a و سپس به داخل ميزبان‌هاي کلون سازي و بياني وارد شد. نتايج توالي يابي کلونيگ موفق ژن CagA را نشان داد و در نهايت ترکيب پروتئيني بدست آمده توسط روش SDS-PAGE و دات بلات تائيد شد. در مرحله بعد ترکيب پروتئيني بدست آمده به 3 مرغ از نژاد HY-LINE تزريق شد. تخم مرغ‌ها به مدت 10 هفته جمع آوري شدند و IgY توليد شده در زرده تخم مرغ آنها با استفاده از روش SDS-PAGE بررسي و تائيد شد.

کلمات کليدي: مهندسي آنتي بادي،کيت تشخيصي، ايمنوژنتيک

فهرست مطالب
عنوان صفحه1 مقدمه1
1-1 اهميت موضوع1
1-2 اهداف تحقيق4
2 بررسي منابع5
2-1 مکمل‌ها و غذاهاي عمل گرا5
2-1-1 تفاوت غذاي عمل گرا و مکمل غذائي6
2-2 ايمنوگلوبين Y6
2-2-1 ايمنوگلوبين زرده ي تخم مرغ (IGY)7
2-2-2 ويژگي‌ها9
2-2-3 کاربرد‌هاي بيوآنالايتيک9
2-2-4 استفاده در مواد غذائي10
2-3 هليکو باکتر پيلوري11
2-3-1 علائم و نشانه‌ها11
2-3-2 ميکروبيولوژي12
2-3-3 ژنوم13
2-3-4 زيرواحد CAGA هليکوباکتر پيلوري14
2-3-5 نقش CAGA در سرطان15
2-3-6 پاتوفيزيولوژي15
2-3-7 التهاب، ورم معده و زخم16
2-3-8 جزيره بيماريزائي CAG17
2-3-9 سرطان18
2-3-10 آسيب شناسي19
2-3-11 پيشگيري19
2-3-12 درمان20
2-3-13 پيش بيني بيماري21
2-3-14 بقاء هليکوباکتر پيلوري22
2-3-15 همه گير شناسي باکتري (EPIDEMIOLOGY)24
2-4 آنتي ژن‌ها25
2-4-1 ساختمان آنتي ژن25
2-5 اپي توپ‌ها26
2-5-1 انواع اپي توپ‌ها26
2-5-2 عملکرد27
2-5-2-1 اپي توپ‌هاي سلول T27
2-5-3 واکنش متقاطع28
2-5-4 نقشه برداري اپي توپ فضائي28
2-5-5 نشانه‌هاي اپي توپ28
2-6 تحقيقات انجام شده در اين زمينه29
2-7 ابزار‌هاي مورد استفاده38
2-7-1 دات بلاتينگ38
2-7- 2 نرم افزار CLC WORK BENCH538
2-7-3 نرم افزار MEGA539
2-7-4 ابزار BLAST39
3 مواد و روش‌ها40
3-1 تعيين نواحي آنتي ژنيک ژن CAGA40
3-2 تهيه باکتري هليکو باکتر پيلوري41
3-3 استخراج DNA و تعيين کميت و کيفيت DNA استخراج شده41
3-3-1 تعيين کميت و کيفيت DNA با ژل آگارز41
3-4 تعيين غلظت DNA استخراج شده42
3-5 طراحي آغازگرها42
3-6 انجام واکنش PCR43
3-7 خالص سازي محصول PCR44
3-7-1 بررسي بر روي ژل الکتروفورز45
3-8 طرز تهيه محلولهاي مورد استفاده در کلونينگ45
3-8-2 محلول غليظ آنتي بيوتيک آمپيسيلين46
3-8-3 محلول غليظ IPTG (0. 1M)46
3-8-4 محلول غليظ X-GAL (20MG/ML)46
3-8-5 محيط کشت LB مايع46
3-8-6 محيط کشت LB-AGAR جامد47
3-9-2 هضم PET-32A (+)49
3-9-3 خالص سازي PET-32A (+) و قطعه هدف49
3-9-4 نانودراپ محصولات خالص شده50
3-9-5 انجام واکنش الحاق قطعه هدف ژن CAGA با PET-32A (+)50
3-9-6 جوان سازي باکتري DH5?51
3-9-7 تهيه سلول‌هاي مستعد DH5?52
3-9-8 انتقال پلاسميد نوترکيب به باکتري52
3-9-9 کشت پرگنه‌‌ها و غربال گري باکتري هاي نوترکيب53
3-9-10 کلوني PCR53
3-9-11 استخراج پلاسميد نوترکيب54
3-9 -12 تاييد کلونيها از طريق هضم آنزيمي55
3-10 توالي يابي56
3-11 انتقال پلاسميد PET-32A (+) حاوي ژن هدف به باکتري BL21 (DE3)56
3-12 تحريک بيان ژن هدف56
3-13 استخراج پروتئين از باکتري57
3-14 الکتروفورز پروتئينها به روش SDS-PAGE58
3-14-1 مراحل بستن ژل به صورت زير انجام شد:59
3-15 دات بلات61
3-16 محلولها و بافرها62
3-16-1 بافر شستشو يا محلول TBS62
3-16-2 محلول بلوکه کننده62
3-16-3 بافر شستشو يا محلول TBS-T62
3-16-4 آنتيبادي اوليه62
3-16-5 آنتيبادي ثانويه62
3-16-6 روش تهيه محلول رنگ آميزي DAB62
3-17 خالص سازي پروتئين64
3-18 آماده سازي آنتي ژن ايمني زا براي تزريق به مرغ64
3-19 ايمني زائي مرغ‌ها جهت توليد آنتي بادي اختصاصي65
3-19-1 تزريق اوليه:65
3-19-2 تزريق‌هاي ثانويه (BOOSTER INJECTION)66
3-20 جمع آوري و ذخيره تخم مرغ66
3-21 جداسازي IGY با استفاده از روش پلي اتيلن گلايکول 600066
3-22 بررسي IGY به روش الکتروفورز SDS-PAGE و دات بلات67
4 نتايج و بحث67
4-1 تعيين نواحي آنتي ژنيک ژن CAGA67
4-2 تاييد آلودگي نمونه‌هاي بيوپسي69
4-3 تعيين کميت و کيفيت DNA69
4-4 بررسي محصولات PCR70
4-5 خالص سازي محصول PCR71
4-6 هضم PET32A (+) و ژن CAGA71
4-7 کلونينگ ژن CAGA در باکتري DH5?72
4-8 تأييد صحت قطعه کلونشده در PET32A (+)73
4-9 نتايج کلوني PCR73
4-10 تاييد نتايج کلوني PCR با استفاده از T774
4-11 استخراج پلاسميد و انجام هضم آنزيمي75
4-12 توالي يابي76
4-13 آناليز فيلوژنتيکي توالي آمينواسيدي CAGA76
4-14 بيان ژن78
4-15 SDS-PAGE78
4-16 دات بلات79
4-18 توليد IGY ضد هليکو باکتر پيلوري-CAGA در زرده تخم مرغ81
5 نتيجه گيري و پيشنهادات85

فهرست شکل‌ها
عنوان صفحه شکل 4-1. نتايج نرم افزار bcepred.68
شکل 4-2. تست اوره آز انجام شده بر روي نمونه‌هاي بيوپسي.69
شکل 4-3. تعيين کيفيت و کميت DNA.70
شکل4-5. خالص سازي محصول PCR . 71
شکل4-6. هضم ناقل بيان و قطعه هدف72
شکل4-7. کشت خطي از تک کلون‌هاي رشد کرده بر روي محيط کشت LB-آگار حاوي آمپي سيلين73
شکل 4-8. کلوني PCR. 74
شکل4-9. کلوني PCR با استفاده از پرايمر T7 و T-terminatoor.75
شکل 4-10. استخراج پلاسميد نوترکيب و هضم آنزيمي76
شکل 4-12. بررسي بيان پروتئين نوترکيب با الکتروفورزSDS-PAGE 78
شکل 4-13. دات بلات پروتئينهاي استخراج شده.79
شکل 4-14.تعيين غلظت پروتئين با استفاده از روش برادفورد81
شکل 4-15.خالص سازي پروتئين و حذف باند‌هاي غير اختصاصي. 81
شکل 4-16. الکتروفورز SDS-PAGE به منظور بررسي پروتئين زنجيره سبک و سنگين IgY استخراج شده از زرده تخم مرغ82

فهرست جدول‌ها
عنوان صفحه جدول 3-1 مواد و مقادير لازم براي انجام PCR يک واکنش43
جدول3-2. برنامه حرارتي مورد استفاده جهت تکثير نواحي آنتي ژنيک ژن CagA44
جدول3-3 مواد مورد نياز جهت تهيه محيط کشت LB مايع46
جدول3-4 مواد مورد نياز جهت تهيه محيط کشت جامد LB-Agar47
جدول 3-5 مواد و مقادير لازم براي انجام واکنش هضم قطعه هدف ژنCagA48
جدول 3-6. مواد و مقادير لازم براي انجام واکنش هضم pET-32a (+)49
جدول3-7. مواد مورد نياز جهت انجام واکنش الحاق50
جدول 3-8. مواد و مقادير لازم براي انجام واکنش هضم پلاسميد pET32a (+)-CagA55
جدول3-9. مواد مورد نياز براي تهيه بافر Laemmli buffer samples 5X58
جدول3-10 مواد و مقادير لازم جهت تهيه ژل پاييني SDS-PAGE58
جدول 3-11 مواد لازم جهت بستن ژل بالايي SDS-PAGE59
جدول3-12. مواد و مقادير مورد نياز براي بافر 5X تانک SDS-PAGE59

فهرست علائم و اختصارات
معادل فارسي معادل لاتين علامت اختصاري آدنوزين دي فسفات Adenosine 5′-Diphosphate ADP
آدنوزين تري فسفات Adenosine 5′-Triphosphate ATP جفت باز Base pair bp سرم البومين گاوي Bovain serum albumin BSA دي آمينو بنزيدين Diamino Benzidine DAB آب دوبار تقطير Double Distilled Water ddW اسيد دزوکسي ريبو نوکلئيک Deoxyribonocleic Acid DNA اتيلن ديامين تترا- استيک اسيد Ethylenediaminetetra-acetic acid EDTA سازمان امنيت محصولات غذايي Generally Regarded As Safe GRAS ايمنو گلوبين Y Immunoglobulin Y IgY ايمنوگلوبين E Immunoglobulin E IgE ايمنوگلوبين G Immunoglobulin G IgG ميواينوزيتول هگزاکيس فسفات myo-Inositol Hexakisphosphate Ins P6 اينوزيتول پلي فسفاتها Inositol Poly Phosphates IPPs تيوگالاکتوپيرانوزيد ايزوپروپيل Isopropyl ? -D-thiogalactopyranoside IPTG اتحاديه بين الملل شيمي خالص و کاربردي- اتحاديه بين المللي بيوشيمي International Union of Pure and Applide Chemistry- International Union of Biochemistry IUPAC-
IUB کيلوباز Kilobase (pair) kb کيلودالتون kiloDalton kDa لوريا- برتاني Lauria – Bertani LB بانک جهاني اطلاعات بيوتکنولوژي National Center of Biotechnology Information NCBI چگالي نوري Optic Density OD چارچوب خواندن آزاد Open Reading Frame ORF واکنش زنجيره‌اي پليمراز Polymerase Chain Reaction PCR پروتئين تيروزين فسفات Protein Tyrosine Phosphatase PTP پلي اتيلن گلايکول Polyethylene glycol PEG3 جايگاه اتصال ريبوزوم Ribosomal Binding Site RBS دور در دقيقه Round per minute rpm سديم دودسيل سولفات –
ژل الکتروفورز پلياکريل آميد Sodium Dodecyl Sulfate –
Polyacryl Amide Gel Electrophoresis SDS-PAGE

فصل اول
1 مقدمه
1-1 اهميت موضوع
به آنچه که کامل کننده رژيم غذايي مورد نياز افراد است، “مکمل” گفته مي شود. انرژي مکمل‌ها بر اساس نوع آن‌ها متفاوت است. به طور کلي مکمل‌هاي غذايي شامل مواد غذايي يعني کربوهيدرات‌ها، پروتئين‌ها، چربي‌ها، املاح، مواد معدني و ويتامين‌ها هستند. از طرفي برخي مواد غذايي هستند که به طور طبيعي داراي اثراتي اثبات شده بر سلامتي مي باشند اما مشاهده شده است که برخي مواد غذايي و يا نوشيدني‌ها داراي اثراتي بر سلامتي هستند که اين اثرات را نمي توان به محتواي مواد مغذي (نظير درشت مغذي‌ها، ويتامين‌ها و يا مواد معدني) آن ماده ي غذايي نسبت داد اين مواد غذائي غذاهاي عمل گرا ناميده مي شوند. امروزه مصرف کنندگان در بسياري از موارد ترجيح مي دهند اقلام مورد نياز خود را از بين غذاهاي عمل گرا انتخاب کنند. غذاهاي عمل گرا محصولاتي مشتق از مواد غذايي مي باشند که علاوه بر ارزش تغذيه اي آن‌ها، موجب ارتقاي شرايط طبيعي فيزيولوژيک يا عملکرد ذهني شده و يا در پيشگيري از اختلالاتي که مي توانند به بيماري منجر شوند، موثر هستند (worldfood. ir).
هليکو باکتر پيلوري شايع‌ترين موجود ذره‌بيني است که انسان‌ها را در بعد جهاني مبتلا به عفونت ساخته است و بيش از نيمي از مردم دنيا آلوده به اين باکتري هستند (انجمن ميکروب شناسي آمريکا، 2013). اين باکتري نوعي باکتري گرم منفي مارپيچي شکل و يک پاتوژن گوارشي انسان است و مهمترين علت بيماري‌هاي معده اي-روده اي از جمله گاستريک مزمن، زخم معده و دوازدهه، سرطان معده و لنفوما است (کاور و بلاسر،1995). بررسي‌هاي اپيدميولوژي و آماري عفونت مزمن H. پيلوري را با سرطان بدخيم معده مرتبط دانسته اند و اين امر موجب شده كه آژانس پژوهش سرطان سازمان بهداشت جهاني (World Health Organization: WHO)اين باكتري را در زمره ي عوامل سرطان زاي کلاس I قرار دهد (سوارز و همکاران،2006). ميزان عفونت H. پيلوري در جهان بطور ميانگين 50% است اما بين شيوع اين عفونت در كشورهاي غربي و كشورهاي آسيايي در حال توسعه تفاوت معني داري وجود دارد (مالاتي و نيرن،2007). به طوري كه اين ميزان در كشورهاي غربي حدودا 30% جمعيت است که از اين ميان بين 1/0-1 درصد به سرطان معده مبتلا مي شوند در حالي که ميزان عفونت در کشور‌هاي آسيائي بالاتر و در حدود 80-60 درصد است (سوربن و ميچتي،2002). عفونت هليکو باکتر پيلوري در ايران نيز شايع بوده و به خصوص سرطان معده از آمار بالائي بر خوردار است. اين سرطان كه مسئول مرگ 650000 نفر در جهان در سال 2000 است، در مردها پس از سرطان ريه دومين عامل مرگ و مير ناشي از سرطان بوده و در مجموع حدود 10 درصد از كل مرگ و مير ساليانه سرطان را به خود اختصاص مي دهد (پرينز و همکاران،2010). ميزان عفونت H. پيلوري در جمعيت اردبيل بالا و در حدود 89 درصد بوده است و يكي از بالاترين آمارهاي جهان در رابطه با سرطان معده مربوط به استان اردبيل است كه به تنهايي حدود يك سوم تمام موارد سرطان در اردبيل بين سال‌هاي 1996 تا 1999 مربوط به اين سرطان بوده است (سجادي و همکاران،2003) (البرزي و همکاران،2006). به علاوه بررسي‌ها در شهر شيراز نيز ابتلاي 98-82 درصد كودكان بين 9 ماهه تا 10 ساله را به اين باكتري نشان مي دهد (البرزي و همکاران،2006) (نديمي و همکاران،2000). فاکتور بيماري زاي cagA هليکو باکتر پيلوري يک پروتئين با وزن مولکولي 120-145KD مي باشد که در فاصله ي Kb 40 جزاير بيماري زائي1 کد شده است. گونه‌هاي هليکو باکتر پيلوري از نظر دارا بودن ژن CagA به گونه‌هاي مثبت2 و منفي3 تقسيم ميشوند که تقريبا 60 درصد گونه‌هاي جدا شده از کشور‌هاي غربي و اکثريت گونه‌هاي جدا شده از شرق آسيا از نوع مثبت بودند (هاتاکياما و هيگاشي،2005). عفونت هليکو باکتر پيلوري با لنفوماي MALT و سرطان معده در ارتباط است و تصور مي شود که CagA در گسترش سرطان نقش داشته باشد (لکس،2005). ژن CagA فسفريله شده قادر به برقراري ارتباط با تيروزين فسفاتاز SHP-2 است که باعث عملکرد فعال و تغئير ظاهري سلول ميزبان به يک فنوتيپ متحرک تر مي شود که به عنوان فنوتيپ مرغ مگس خوار شناخته شده است (هاتاکياما و هيگاشي، 2005). اين فنوتيپ شبيه به اثر توليد شده توسط فاکتور رشد کبدي بوده که ممکن است در جنبه‌هاي مختلف سرطان از جمله متاستاز دخالت داشته باشد (لکس،2005). همچنين CagA يک پروتئين داراي خاصيت آنتي ژنيکي بسيار قوي است که با واکنش‌هاي برجسته ي التهابي توليد شده به وسيله ي استخراج اينترلوکين-8 در ارتباط است (يامائوکا،2010). تشخيص سرطان معده در مراحل اوليه دشوار است و در اكثر موارد تشخيص پس از پيشرفت بيماري صورت گرفته و کار درمان سخت مي شود در نتيجه مانند التهاب و زخم معده راه اصلي مبارزه با اين سرطان نابود کردن عفونت H. پيلوري است از طرفي به دليل اينکه سيستم ايمني بدن در مقابل H. پيلوري داراي مکانيسم دفاعي است و حتي طي مكانيز م‌هاي ويژ ه اي در خدمت بيمار يزايي باكتري قرار مي گيرد و سبب تسهيل اتصال باكتري وتخريب بافت پوششي مي شود مبارزه با اين عفونت همواره با مشکلاتي همراه است. (سوارز و همکاران،2006). بعلاوه بررسي‌هاي اخيرنشان دهنده ي مقاومت نسبتا زياد H. پيلوري به درمان‌هاي آنتي بيوتيکي است (موبلي و همکاران،1995). در نتيجه درمان‌هاي اخير در جهت بکارگيري درمان‌هاي اختصاصي و نوين براي مقابله با اين عفونت است که در اين ميان پروتئين CagA که يکي از پروتئين‌هاي H. پيلوري است هدف بالقوه مناسبي براي توليد آنتي بادي‌هاي اختصاصي به اين منظور است. از سوي ديگر امروزه، در عرصة كاربرهاي متنوع آنتي بادي‌ها، تكنولوژي جديد استخراج IgYاز زرده ي تخم مرغ در حال گسترش است. IgY که معادل IgG انساني در پرندگان در نظر گرفته مي شود در واقع از نظر تکاملي،نياي مادري IgG و IgE پستانداران است. اين ايمنوگلوبين توسط مرغ توليد شده و براي ايجاد ايمني غير فعال براي جنين به درون زرده تخم مرغ انتقال مي يابد. تکنولوژي IgY از اين پديده از طريق استخراج IgY از زرده ي تخم مرغ بهره مي برد (بصيري و همکاران،2008). براي توليد يک واکسن موثر بر عليه هليکو باکتر پيلوري، آنتي ژني پايدار،حفاظت شده و قوي مورد نياز است. امروزه تکنولوژي استفاده از آنتي ژنهاي نوترکيب پروتئيني براي ايمن سازي به سمت شناسائي اپي توپ‌هاي اصلي آنتي ژن براي تحريک ايمني و استفاده از آنها بجاي پروتئين کامل پيش مي رود. مطالعات نشان داده که پروتئين‌هاي نوترکيب در اکثر موارد خواص ساختاري پروتئين طبيعي را دارد. توليد پروتئين در حالت طبيعي بسيار اندک است اما ميتوانيم در حالت نوترکيب به ميزان دلخواه آن را افزايش دهيم بعلاوه خالص سازي پروتئين‌هاي نوترکيب نسبت به پروتئين‌هاي طبيعي راحت تر صورت ميگيرد و در مورد باکتري‌هاي با رشد نسبتا کم و پر نياز مثل هليکوباکتر پيلوري توليد پروتئين‌هاي نوترکيب در مقايسه با پروتئين‌هاي طبيعي بسيار مقرون به صرفه است. در صورت استفاده از اپي توپ‌هاي اصلي آنتي ژن بجاي آنتي ژن کامل علاوه بر کوچک شدن قطعه مورد بررسي و بالا رفتن اختصاصيت قطعه که باعث تحريک شدن پاسخ‌هاي ايمني اختصاصي تر مي شود تکثير و ترکيب آن با ساير آنتي ژنها راحت تر صورت ميگيرد (ابطحي و همکاران،2012). مطالعات نشان داده که در زرده ي تخم مرغ حاصل از مرغ‌هاي ايمن شده مقادير زيادي آنتي بادي وجود دارد که ميتوانند آنتي ژن‌ها را بطور اختصاصي شناسائي کنند و از نظر اقتصادي بسيار مقرون به صرفه هستند (وردولاوا و همکاران،2000). بعلاوه شاين و همکاران تاثير Igy ضد H. پيلوري بدست آمده از مرغ‌هاي ايمن شده را گزارش کردند که در اين مطالعه Igy موجب کاهش التهاب لايه مخاطي معده گرديد. بعلاوه ميزان التهاب با تعيين ميزان لنفوسيت‌هاي بافتي و نفوذ نوتروفيل‌ها مشخص شد (شاين و همکاران،2003). بنابراين ميتوان از آنتي بادي اختصاصي توليد شده در زرده ي تخم مرغ براي درمان بيماران مبتلا به عفونت H. پيلوري استفاده کرد.
1-2 اهداف تحقيق
با توجه به گسترش روز افزون بيماران مبتلا به هليکو باکتر پيلوري در سطح ايران و جهان و عدم پاسخ دهي مناسب افراد مبتلا به عفونت H. پيلوري به درمان‌هاي آنتي بيوتيکي هدف از اين تحقيق شناسائي و تعيين نواحي آنتي ژنتيک ژن CagA هليکوباکتر پيلوري با استفاده از نرم افزارهاي بيوانفورماتيکي، ساخت ناقل نوترکيب حامل نواحي آنتي ژنتيک ژن CagA و توليد IgY بر عليه هليکو باکتر پيلوري در زرده ي تخم مرغ مي باشد. تا در آينده از طريق بهبود کيفت تخم مرغ و توليد غذاهاي عمل گرا و مکمل به جلوگيري از عفونت ناشي از اين باکتري کمک کند و يا در کيت‌هاي تشخيصي بکار گرفته شود.

فصل دوم
2 بررسي منابع
2-1 مکمل‌ها و غذاهاي عمل گرا
به آنچه که کامل کننده رژيم غذايي مورد نياز افراد است، “مکمل” گفته مي شود. مفهوم غذاي عمل گرا (functional food) از آن جا شکل گرفت که مشاهدات نشان دادند که برخي مواد غذايي و يا نوشيدني‌ها داراي اثراتي برسلامتي هستند که اين اثرات را نمي توان به محتواي مواد مغذي نظير درشت مغذي‌ها،ويتامين‌ها و مواد معدني آن ماده ي غذايي نسبت داد. اگرچه ممکن است اين واژه براي غذاهايي که تغيير يافته و يا با ساير مواد غذايي ترکيب شده اند به کار برود. امروزه غذاي عمل گرا به ماده ي غذايي اي اطلاق مي شود که داراي اثراتي فراتر از ارزش تغذيه اي و يا محتواي مواد مغذي خود بر سلامتي انسان باشد. بررسي‌ها نشان مي دهند که امروزه مصرف کنندگان در بسياري از موارد ترجيح مي دهند اقلام مورد نياز خود را از بين غذاهاي عمل گرا انتخاب کنند. مهم ترين اثراتي که براي اين مواد غذايي قابل ذکر است، عبارتند از: تأثير بر ارتقاي سيستم ايمني، دارا بودن خصوصيات آنتي اکسيداني، ضدالتهاب بودن، سميت زدايي و يا اثرات کارافزايي (ارگوژنيک).
مهم ترين مواد غذايي که براي بررسي خصوصيات عمل گرايي آن‌ها مورد تحقيق قرار گرفته اند، ترکيبات شيميايي فنوليک با منشاء گياهي، باکتري‌هاي پروبيوتيک، فيبرها و ساير کربوهيدرات‌ها با هضم ناقص مي باشند، اما آغوز و زرده تخم مرغ و برخي ديگر از مواد غذايي غير گياهي نيز به عنوان غذاهاي عمل گرا در نظر گرفته مي شوند. اگرچه اثرات بسياري از اين مواد غذايي در مطالعات برون سلولي و نيز بر روي حيوانات آزمايشگاهي به اثبات رسيده است، اما براي بررسي اثرات دقيق آن‌ها در مطالعات انساني هنوز مسير پرچالشي در پيش است. با توجه به اهميت و اثرات اين مواد غذايي بر سلامتي، افزايش قابل توجه تحقيقات در خصوص اين مواد غذايي و عرضه روز افزون فرآورده‌هايي با تبليغ دارا بودن خصوصيات عمل گرايي، آگاهي نسبت به اصول مرتبط با غذاهاي عمل گرا و داشتن يک تصور ذهني براي ارزيابي اين مواد غذايي براي عامه مردم و به ويژه متخصصين الزامي به نظر مي رسد.
2-1-1 تفاوت غذاي عمل گرا و مکمل غذائي
در رايج ترين تعريف، غذاهاي عمل گرا محصولاتي مشتق از مواد غذايي مي باشند که علاوه بر ارزش تغذيه اي آن‌ها، موجب ارتقاي شرايط طبيعي فيزيولوژيک يا عملکرد ذهني شده و يا در پيشگيري از اختلالاتي که مي توانند به بيماري منجر شوند، موثر هستند. در بسياري از کشورها غذاهاي عمل گرا از مواد غذايي و يا نوشيدني‌هايي تشکيل مي شوند که همانند نوشيدني‌ها و غذاهاي عادي مصرف شده و به عنوان دارو تلقي نمي شوند. قابل توجه آن که در صورتي که غذاهاي عمل گرا به صورت قرص، ساشه و فرم‌هاي مشابه بسته بندي شوند، ديگر به عنوان غذاي عمل گرا محسوب نشده و به عنوان يک مکمل غذايي در نظر گرفته مي شوند. آينده ي غذاهاي عمل گرا، بيش از قوانين و مقررات دولتي و نهادهاي نظارتي، به تحقيقات علمي در مورد آن‌ها بستگي داشته و هنوز مفهوم کلي غذاي عمل گرا قابل انعطاف و سيال است (worldfood. ir)
2-2 ايمنوگلوبين Y
ايمنوگلوبين Y آنتي بادي اصلي در پرندگان، خزندگان و خون ماهيان ريه دار است. اين ايمنوگلوبين در غلظت‌هاي بالا در زرده تخم مرغ يافت مي شود. همانند ساير ايمنوگلوبين‌ها، IgY طبقه اي از پروتئين‌هاست که توسط سيستم ايمني در مقابل برخي مواد خارجي ساخته مي شوند و بطور خاص آنها را شناسائي ميکنند. با توجه به شباهت‌هاي کاربردي IgY به ايمونوگلوبين G ( (IgGو ايمنوگلوبينE ( (IgE، اين ايمنوگلوبين در زمان‌هاي قديم اغلب با IgG اشتباه گرفته ميشد- حتي در برخي از کاتالوگ‌هاي محصولات تجاري- اما از زماني که تفاوت‌هاي ساختاري و عملکردي IgY با IgG و عدم وجود واکنش متقابل بين آنها مشخص شد اين نام گذاري منسوخ گشت (لارسون و همکاران،1993).
2-2-1 ايمنوگلوبين زرده ي تخم مرغ (IgY)
حضور آنتي بادي IgY در خون و تخم مرغ قابل رديابي است. توليد IgYدر زردة تخم مرغ روش اقتصادي و مؤثر براي افزايش آنتي بادي‌هاي پلي كلونال مي باشند. به طور مثال يك مرغ تخم گذار مي تواند آنتي بادي معادل با 90 – 75 ميلي ليتر از سرم يا 180 – 150 ميلي ليتر از كل خون را در طي يك هفته در زردة تخم مرغ توليد كند. در حاليكه از خرگوش تقريباً در هر هفته 20 ميلي ليتر خون گيري مي شود. فقط پستانداران بزرگتر مثل گاو و اسب مي توانند آنتي بادي‌هاي بيشتر از مرغ توليد كنند‌‌‌‌ (کارلاندر،2002). در سال2000 محققان مقادير زيادي آنتي بادي را در زرده تخم مرغ حاصل از مرغ‌هاي ايمن شده يافتند که قادر به شناسائي اختصاصي آنتي ژن بوده و از نظر اقتصادي بسيار مقرون به صرفه بودند (وردولوا و همکاران،2000). خواص ضد باكتريايي IgY يكي از مهمترين جنبه‌هاي مطالعه IgY است. بسياري از گزارشات نشان ميدهد كه IgY مي تواند داراي عملكرد ايمني زايي در عفونت‌هاي باكتريايي و ويروسي در موجودات زنده باشند (کروگر و همکاران،2004) (وان نگوين و همکرارن،2006). در سال 1994 پرالتا و همكارانش از IgY توليد شده عليه سالمونلا انتريتيديس براي جلوگيري از سالمونلوزيس در موش‌ها به صورت خوراكي استفاده كردند. اين نتايج نشان داد كه IgY مي تواند نقش مهمي در ايمني زايي داشته باشد‌‌‌‌ (پرالتا و همکاران،1994). در سال 1997‌هاتا و همكارانش از IgY توليد شده عليه استرپتوكوكوس موتانس در جهت جلوگيري از ايجاد پلاك دنداني استفاده كردند. كه سبب كاهش استقرار اين باكتري در دندان شده است‌‌‌ (هاتا و همکاران،1997). علاوه بر استفاده از IgY عليه بيماري‌هاي باكتريايي، اين آنتي بادي عليه بيماري ويروسي نيز استفاده شده است. در سال 1993 کروکي و همكارانش از IgY توليده شده عليه روتا ويروس در مدل موش استفاده كردند كه سبب كاهش اسهال در آنها شد‌‌‌‌ (کروکي و همکاران،1993). بعلاوه مشخص شده است که ايمن سازي با آنتي ژن‌هاي طبيعي و يا نوترکيب ميتواند در برابر عفونت H. پيلوري حفاظت بخش باشد (کولسينگ و همکاران،2001) (بييل و همکاران،2004). در سال 2002 تاثير Igy ضدH. پيلوري بدست آمده از مرغ‌هاي ايمن شده با عصاره ليز سلولي اين باکتري در مونگولين جربيل4 که آلوده به H. پيلوري است را گزارش شده است. در اين مطالعه Igy ضد H. پيلوري موجب کاهش التهاب لايه مخاطي معده که توسط اين باکتري تحريک ميشود گرديد بعلاوه ميزان التهاب با تعيين ميزان لنفوسيت‌هاي بافتي و نفوذ نوتروفيل‌ها مشخص شد (شاين و همکاران، 2002). نيلسون پروتئين‌هاي حفاظت بخش هليکوباکتر پيلوري نظيرUreC،HpaA ، FlaA، CagAوVacA را معرفي کرد (نيلسون،2000). IgY کاملاً به حرارت مقاوم است و فعاليت ايمونولوژيکي آن تحت تاثير پاستوريزاسيون كاهش نمي يابد‌‌‌‌ (هاتا و همکاران،1993). تفاوت فيلوژنتيكي زيادي بين گونه پستانداران و پرندگان وجود دارد. اين اختلاف تكاملي سبب مي شود آنتي بادي مرغي در مقايسه با آنتي بادي‌هاي پستانداران به اپي توپ‌هاي بيشتري بر روي پروتئين‌هاي پستانداران متصل شود. در نتيجه آنتي بادي‌هاي مرغي داراي حساسيت بالايي مي باشند بطوري که تحقيقات نشان مي دهد آنتي بادي مرغي 5-3 برابر بيشتر از آنتي بادي خوک به IgG خرگوش متصل مي شود (هاتا و همکاران،1993) (اولوسون و همکاران،1993). از آنجائي که مرغ‌ها تقريبا هر روز تخم ميگذارند و زرده تخم مرغ مرغ‌هاي ايمن سازي شده حاوي مقادير بالائي از IgY است،مرغ‌ها به تدريج به يک منبع آنتي بادي سفارشي محبوب براي پژوهش‌ها ي دانشمندان تبديل شدند. (معمولا آنتي ژن مورد علاقه دانشمندان به پستانداران مثل خرگوش و بز تزريق مي شود) (REVIEW – Chicken Antibodies- IgY).
اردک فرم کوتاهي از IgY را توليد ميکند که قسمتي از منطقه Fc را از دست داده است در نتيجه نمي‌تواند به طور کامل باند شده و يا توسط ماکروفاژها برداشته شود (ديويسن،2008) (لاندکوئيس و همکاران،2005). اين ميتواند يکي از دلايلي باشد که اردک‌ها به نسبت مرغ‌ها کمتر به راحتي توسط آنفولانزاي مرغي کشته مي شوند هرچند هنوز ميتوانند آلوده شوند و به راحتي ويروس را منتقل کنند. IgY همچنين در لاک پشت نرم تن چيني مورد تجزيه و تحليل قرار گرفته است (زين و همکاران،2009).
2-2-2 ويژگي‌ها
در جوجه‌ها ايمنوگلوبين Y از نظر عملکردي شبيه ايمنوگلوبينG (IgG) است و درست شبيه IgG از دو زنجيره سبک و دو زنجيره سنگين تشکيل شده است. از لحاظ ساختاري تفاوت اين دو نوع ايمنوگلوبين در درجه اول در زنجيره‌هاي سنگين است که IgY داراي جرم مولکولي 65100 واحد جرم اتمي (amu) وبزرگتر از IgG است. زنجيره‌هاي سبک در IgY با وزن مولکولي تقريبا 18700 آمو تا حدي از زنجيره‌هاي سبک در IgG کوچکتر بوده و بنابراين وزن مولکولي IgY تقريبا 167000 آمو است. انعطاف پذيري مولکول‌هاي IgY کمتر از IgG است. عملکرد IgY تا حدي با ايمنوگلوبين E (IgE) و IgG قابل مقايسه است. در مقايسه با IgG،IgY به پروتئين‌هاي A، G و يا به گيرنده‌هاي FC متصل نمي شود و سيستم مکمل را فعال نميکند. پس از آنکه در سال 1969 لسلي و کِلِم توانستند تفاوت بين ايمنوگلوبين موجود در زرده تخم مرغ و ايمنوگلوبين G را نشان دهند نام ايمنوگلوبين Y را براي اين ايمنوگلوبين متفاوت پيشنهاد کردند. ديگر نام‌هاي مترادف با IgY عبارتند از IgG مرغ،IgG زرده تخم مرغ و 7S-IgG.
2-2-3 کاربرد‌هاي بيوآنالايتيک
IgY بصورت خوراکي ايمونوژن است و اگر بصورت داخل وريدي به موش تزريق شود سبب ايجاد پاسخ ايمني مي گردد اما توليد IgY در زرده تخم مرغ از لحاظ اقتصادي بسيار مرقون به صرفه بوده و در مقايسه با IgG حجم زيادي از آنتي بادي را مي توان توليد نمود بدون آنکه به حيوان آسيبي برسد (اسچيد و همکاران،1996). در مقايسه با آنتي بادي‌هاي پستانداران،IgY مزاياي بسياري براي استخراج هدفمند از آنتي بادي‌ها و کاربرد‌هاي انها در آناليز‌هاي بيولوژيکي دارد. از آنجائي که آنتي بادي‌ها از زرده تخم مرغ‌هاي گذاشته شده استخراج مي شوند اين روش يک روش غير تهاجمي است و نيازي به گرفتن خون از حيوانات براي استخراج از سرم خون نيست. مقدار آنتي بادي بدست آمده از تخم مرغ‌هاي مربوط به يک مرغ، مکررا به طور قابل ملاحظه اي افزايش داشته است. همچنين واکنش متقابل IgY با پروتئين‌هاي پستانداران بطور قابل توجهي کمتر از IgG است و بعلاوه پاسخ ايمني ايجاد شده در برابر آنتي ژن‌هاي خاص در مرغ‌ها بسيار قوي تر از خرگوش يا ساير پستانداران است.
از ايمنوگلوبين‌هاي توليد شده در طول پاسخ ايمني تنها IgY در تخم مرغ‌ها يافت مي شود بنابر اين در تهيه آنها از تخم مرغ‌ها هيچ گونه آلودگي با ايمنوگلوبين A (IgA) يا ايمنوگلوبين M (IgM) وجود ندارد. عملکرد IgY موجود در تخم مرغ با IgG بدست آمده از سرم خرگوش قابل مقايسه است. يکي از مضرات IgY در مقايسه با آنتي بادي‌هاي پستانداران اين است که جداسازي IgY از زرده تخم مرغ بسيار مشکل تر از جداسازي IgG از سرم خون است. اين مسئله تا حد زيادي به خاطر اين واقعت است که IgY نميتواند با پروتئين A و پروتئين G باند شود بنابراين نميتوان آن را از ساير اجزاء آزمايش مثل ساير پروتئين‌ها جدا کرد. بعلاوه ذخاير سرشار از چربي‌ها و ليپوپروتئين‌هاي زرده تخم مرغ بايد حذف شود (الوايرا شکليز،1996). از سوي ديگر آنتي بادي‌هاي سرم خون گاهي ميتوانند بطور مستقيم در آناليز‌هاي بيولوژيکي (بدون مراحل پيچيده جداسازي) استفاده شوند.
2-2-4 استفاده در مواد غذائي
به خصوص در کشور‌هاي آسيائي IgY به عنوان يک عنصر در مواد غذائي استفاده مي شود مثلا فرآورده‌هائي از ماست توزيع شده که شامل IgY اختصاصي بوده و مانع از حمله گونه‌هاي هليکوباکتر پيلوري به معده مي شوند. IgY استفاده شده براي اين منظور از تخم مرغ‌هاي واکسينه شده تهيه شده است. آنتي بادي‌هائي در مقابل سالمونلا و ساير باکتري‌ها و همچنين در مقابل ويروسها به همين شيوه توليد شده و به عنوان يک ترکيب خوراکي براي محافظت از اين پاتوژن‌ها به کار گرفته شده اند (سوزوکي و همکاران،2004) (هوريه و همکاران،2004).
IgY که بصورت خوراکي مصرف مي شود در معرض دناتوره شدن توسطpH اسيدي معده و تجزيه توسط آنزيم‌هاي پروتئازي قرار مي گيرد. اما مطالعات نشان داده که بخشي از آنتي بادي‌ها بصورت سالم باقي مي مانند و بخش ديگري از آنها به قطعات2, Fc ُ Fab, Fabتجزيه مي شوند. با اين وجود، قطعات 2ُ Fab و Fab هنوز توانايي اتصال به آنتي ژن را حفظ نموده اند (کارلاندر،2002). از ديگر مزاياي اين روش وجود واکنش متقاطع اين آنتي بادي با باکتري‌هاي بيماري زا مي باشد اما استفاده از آنتي بادي مرغي مي تواند داراي معايبي از جمله امکان واکنش متقاطع با باکتري‌هاي غير بيماري زاي روده اي بوده که با ايجاد تغيير در فلور طبيعي روده ممکن است زمينه ايجاد بعضي از بيماري‌ها را فراهم سازد.
2-3 هليکو باکتر پيلوري
هليکوباکتر پيلوري در ابتدا کمپيلوباکتر پيلوري ناميده مي شد و بعد‌ها به نام C. پيلوري تغيير نام داد. زماني که در سال 1989 توالي يابي ژن RNA ريبوزومي و ساير مطالعات نشان داد که اين باکتري به جنس کمپيلوباکتر تعلق ندارد آن را در جنس خودش يعني هليکوباکتر قرار دادند. لقب خاص پيلوري از پيلور و يا از دريچه پيلور (دريچه اي در معده که به دوازدهه باز مي شود) و از کلمه اي يوناني به معني دروازه بان گرفته شده است (ليدل و اسکات،1996). هليکو باکتر پيلوري شايع ترين باکتري است که جوامع انساني را در بعد جهاني مبتلا به عفونت کرده است (سزين و ندرد،1991). بيش از 80% از افراد آلوده به اين باکتري بدون علامت هستند و بديهي است که ممکن است نقش مهمي را در اکولوژي طبيعي معده بازي کند (بلاسر،2006). بيش از 50% جمعيت جهان H. پيلوري را در قسمت فوقاني دستگاه گوارش خود دارند. عفونت در کشور‌هاي در حال توسعه شايع تر است و بروز آن در کشور‌هاي غربي در حال کاهش است. تصور مي شود شکل مارپيچ H. پيلوري (که از نام عمومي آن گرفته شده است) به منظور نفوذ به پوشش مخاطي معده تکامل يافته است (يامائوکا و يوشيو،2008) (برون،2000). اهميت H. پيلوري تا حدي است که در سال 2005 جايزه ي نوبل پزشکي به باري مارشال و رابين وارن، دو پزشک و دانشمند استراليائي، بخاطر کشف هليکوباکتر پيلوري و نقش آن در بيماري‌هاي التهاب و زخم معده اهدا شد. آنها کشف کردندکه



قیمت: تومان


پاسخ دهید