گياه توسط قارچ نتايج حاکي از نقش موثر اين قارچ در بهبود خصوصيات گياه جو تحت شرايط خشکي دلالت دارد.
هم چنين اين آزمايش نشان داد که با توجه به شرايط اقليمي کشور ايران استفاده از اين قارچ براي رشد عملکرد گياهاني نظير گندم و جو تحت شرايط خشکي مي تواند سودمند واقع شود(بل و همکاران1995).111
در آزمايشي ديگر به خواص باکتري هاي اندوفيت در گياه سيب زميني پرداخته شد. در اين تحقيقات باکتري هاي اندوفيت مرتبط با گياه سيب زميني جداسازي و شناسائي شدند و از نظر قدرت تثبيت نيتروژن توليد اندول استيک اسيد و تحمل به تنش مورد آزمايش قرار گرفتند. اندوفيت هاي شناسائي شده متعلق به جنس انتروباکتر112، رودانوباکتر113، سودوموناس114، گزانتوموناس115 و ميکسو باکتر116 بودند.
در اين تحقيق مشخص شد که چهار سويه قادر به توليد هورمون رشد گياهي يعني اندول استيک اسيد و يک گونه توانائي رشد در محيط حاوي نيتروژن آزاد و توليد سابيونيت نيتروژناز nifH مي باشند.
هم چنين مشخص شد که چنانچه سويه هاي توليد کننده اندول استيک اسيد را به قلمه ها تلقيح کنند توليد ريشه چه زودتر و سريع تر رخ مي دهد.
اين مطالعه نشان داد که اندوفيت هاي باکتريايي در رشد گياه سيب زميني نقش مفيدي داشتند(استورز1995)117.
فصل سوم
مواد و روش ها
3-1- تجهيزات و دستگاه ها
1) ميکروسکوپ نوري: براي ديدن باکتري هاي جدا شده.
2) همزن مغناطيسي: براي همزدن مخلوط ها، محلول ها و کمک به انحلال مواد.
3) سانتريفيوژ: براي جدا کردن رسوب و اجسام سنگين موجود در مخلوط هاي به کار رفته.
4) PH متر: جهت اندازه گيري PH محلول ها و ساختن بافر ها.
5) ترازوي ديجيتال: جهت توزين مواد بکار رفته.
6) انواع سمپلر: براي برداشتن حجم هاي مشخص از مايعات مورد استفاده.
7) بن ماري: براي تامين دماهاي خاص و آزمايش هاي مختلف.
8) شيکر انکوباتور دار: براي همزدن مواد.
9) دستگاه اتوکلاو: براي استريل کردن محيط هاي کشت و وسايل مورد استفاده.
10) انکوباتور: براي گرمخانه گذاري کشت هاي باکتريايي و قارچي.
جدول 3-1 مواد شيميايي استفاده شده
شرکت سازنده
ماده ي شيميايي
شرکت سازنده
ماده ي شيميايي
Merck
فنل رد
Merck
کلريد جيوه
Merck
قرمز متيل
Merck
هيپوکلريت سديم
Merck
الکل اتيليک
Merck
اتانل 70%
Merck
نشاسته
Merck
Nacl
Merck
آگار
Merck
KOH
Merck
پپتون
Merck
اسيدسولفوريک
Merck
KNO3
Merck
آلفا نفتول
3-2- انواع و ترکيبات محيط کشت هاي مورد استفاده
محيط کشت هاي انتخابي و مورد استفاده در اين تحقيق به استناد و بررسي چندين مطالعه بر اساس کتاب Micribiological media و باکتري شناسي آزمايشگاهي تهيه شده اند. محيط هاي مورد استفاده در بخش ضميمه آورده است.
3-3-نوع مطالعه و روش نمونه گيري
نوع مطالعه مطالعه تحليلي مي باشد. نمونه گيري در دي ماه1390 انجام شد . نمونه ها از مناطق مختلف از جمله باغ تحقيقات کشاورزي گرگان، جنگل توسکستان و مزرعه کتول جمع آوري شد. گياهان داروئي نعناع فلفلي، مارچوبه و بابونه را از مناطق مذکور توسط يک بيلچه استريل به همراه خاک اطراف ريشه برداشته و در بسته هاي نايلوني گذاشته و مشخصات آن را يادداشت نموده و سريعا” براي شروع تحقيقات به آزمايشگاه ميکروبيولوژي تحقيقات آب و خاک مرکز تحقيقات کشاورزي گلستان انتقال داده شدند.
3-4-وسايل نمونه گيري
1) بيلچه
2) نايلون براي نگهداري گياهان مورد آزمايش
3-5-وسايل آزمايشگاهي
ماژيک مارکر، پليت يکبار مصرف، لوپ، آنس، چراغ الکلي، لام شيشه اي، سواپ، تيغ بيستوري.
3-6-انتخاب محيط کشت غربالگري
زيستگاه هاي طبيعي به علت پيچيدگي هاي اکوسيستم هاي موجود حاوي انواع مختلفي از ميکروارگانيسم ها هستند و جداسازي سويه ي ميکروبي داراي خواص مورد نظر از اين مجموع نيازمند فراهم کردن شرايط مشابه زيست محيطي آن را دارد.
يکي از راه هاي متداول استفاده از اين محيط هاي کشت انتخابي است. محيط هاي انتخابي به دليل داشتن عوامل اختصاصي در نظر گرفته شده در آنها قادر هستند دسته ي مشخصي از ميکروارگانيسم ها را در خود رشد داده و جدا نمايند. عمدتا” اين عوامل اختصاصي با در نظر گرفتن خاصيت و ويژگي هايي از ميکروارگانيسم هاي مورد مطالعه مربوط مي شوند. از آنجائيکه از ابتدا نمي دانيم که چه نوع باکتري هايي را جدا خواهيم نمود بنابراين نياز به محيطي داريم که اکثر باکتر ي ها قادر به رشد روي آن مي باشند و در واقع محيط پايه ي رشد باکتري ها مي باشد. براي کشت اوليه ي اين تحقيق از نوترينت آگار و پپتون سويا آگار استفاده شد.
3-7-جداسازي باکتري هاي اندوفيت از ريشه گياهان دارويي
نمونه هاي انتقال داده شده به آزمايشگاه را براي مراحل اوليه آماده نموديم. باکتري هاي اندوفيتيک بر اساس روش ارائه شده توسط هونگ و آناپورنا جداسازي گرديدند(2004). ابتدا براي از بين بردن گل و لاي سطحي نمونه ها با آب شهري شستشو داده شدند. تا همراه گل و لاي ميکروب هاي سطحي آن نيز جدا شوند زيرا هدف باکتري هاي اندوفيت مي باشد . بعد از شستشوي کامل با آب شهري نمونه ها توسط اسکالپر استريل به قطعات 3-2 سانتي متري برش داده شدند. سپس بخش هاي جداسازي شده ابتدا با آب مقطر در پليت شسته شدند و بوسيله يک پنس استريل به پليت ديگر منتقل شدند و به مدت 1دقيقه در الکل اتيليک 70% قرار داده شدند و دوباره با پنس استريل به پليت ديگر منتقل شدند و به مدت 5 دقيقه در هايپرکلريت سديم 2% غوطه ورشده و در مرحله ي بعد با پنس استريل به پليت استريل ديگر منتقل شدند و 5 بار با آب مقطر استريل شسته شدند تا کاملا سطحشان عاري از مواد ضد عفوني کننده شود. بعد از اين مرحله نمونه ها را به ظرف کلريد جيوه 0.1 درصد به مدت دو دقيقه منتقل نموديم و در نهايت آنها را 4-3 بار با آب مقطر استريل شستشو داديم .
بعد از استريليزاسيون سطحي نمونه هاي ريشه اي را به پليت هاي استريل يکبار مصرف منتقل شدند. سپس در کنار شعله توسط ميله ي شيشه اي ته گرد کامل”نمونه هاي ريشه اي له شدند تا کامل” بافت دروني آن خارج شود و بعد از اين مرحله سواپ تميز و استريلي بر داشته و آن را درون بافت له شده چرخانده تا کاملا” با نمونه ها آغشته شود و سپس روي محيط کشت نوترينت آگار و پپتون سويا آگار کشت داديم و محيط هاي کشت را به مدت 24 ساعت در دماي اتاق انکوبه نموديم.
3-7-1- خالص سازي کشت هاي باکتريايي
پس از بررسي هاي اوليه مشاهدات مورفولوژيکي و ميکروسکوپي انجام رنگ آميزي گرم و بررسي نتايج آن و نتايج تست هاي بيوشيميايي (بر اساس کتاب برجي )جنس باسيلوس شناسائي شد. سپس انواع کلني ها به طور مجزا کشت داده شدند تا مورد استفاده قرار گيرند.
3-8- شناسائي مقدماتي جنس و گونه ي جدايه هاي باکتريايي (مورفولوژي و تست هاي بيوشيميايي)
براي تاييد و شناسائي نهائي جنس باسيلوس تست هاي بيوشيميايي بر اساس کتاب برجي و با جداول مورد نظر مطابقت داده شدند. با جمع بندي نتايج بررسي هاي ماکروسکوپي و ميکروسکوپي و در نهايت با انجام اين تست هاي بيوشيميايي باسيلوس ها تا حد جنس شناسائي شدند. ويژگي هاي بيوشيميايي جدايه ها مانند: رشد در نمک هفت درصد رشد در محيط نوترينت آگار، SIM، کاتالاز، هيدروليز نشاسته، هيدروليز ژلاتين، فعاليت اوره آز، مصرف قندهاي مختلف بررسي شدند.
3-8-1- بررسي توانائي رشد در غلظت هاي مختلف NaCl
براي بررسي محدوده رشد در حضور غلظت هاي NaCl از محيط نوترينت آگار استفاده شد. رشد سويه ها در غلظت هفت درصداز NaCl بعد از 2 و 4 روز بررسي شد.
3-8-2- بررسي فعاليت آنزيمي
3-8-2-1- فعاليت اوره آزي
تعيين فعاليت اوره آزي با استفاده از محيط اوره آگار صورت گرفت. تجزيه اوره همراه با آزاد شدن آمونياک و افزايش PH به حدود8/4 باعث تغيير رنگ معرف فنل رد از صورتي به بنفش تيره مي شود.
3-8-3- بررسي فعاليت تجزيه اي
3-8-3-1- تجزيه نشاسته
جهت بررسي توانائي باکتري در توليد آنزيم هاي آلفا آميلاز و اليگو 1و6 بتاگلوکوزيداز از محيط نوترينت اگار حاوي دو درصد نشاسته استفاده شد. توانائي تجزيه ي نشاسته پس از رشد باکتري بر روي محيط پايه با پوشاندن سطح پليت با معرف لوگول بررسي شد. معرف مذکور با نشاسته باقي مانده در محيط رنگ آبي تيره ايجاد مي کند و جدايه هايي که با افزودن معرف ناحيه شفاف در اطراف کلني آنها مشاهده شد به عنوان جدايه هايي با توان تجزيه مثبت گزارش شدند.
جدول 3-2 محيط هاي مورد نياز براي انجام تست هاي بيوشيميايي
Reagent used
Time of incubation
Medium
Test
Pate flooded with 1%iodine sotion
24 h
Starch agar
Starh hydrolysis (amylase activity)
_
24 h
Skimmed milk agar
Casein hydrolysis (Proteas activity)
Kovaks reagent يا ارليش
24 h
Pepton broth
production Indol
40%KOH5%alpha naphtol
48h
MR-VP broth
Aceton production
Hydrogen proxide
48h
Starch casein broth
production Catalas
معرف نيترات
24 h
Nutrient broth+
KNO3
Nitrat reductio
3-9- شناسايي تکميلي(شناسايي مولکولي با روش ريبوتايپينگ)
استخراج DNA هاي باکتري هاي ايزوله شده با استفاده از کيت خريداري شده از شرکت سيناژن صورت گرفت. استخراج ژن با استفاده از پروتکل کيت شرکت سيناژن به شرح زير انجام گرفت:
1) به نمونه هاي ايزوله شده صد ميکروليتر Protease Buffer اضافه نموده و نمونه ها به مدت ده دقيقه در دماي نودوپنج درجه سانتي گراد قرار داده شدند.
2) چهارصد ميکروليتر محلول ليز کننده را به ميکروتيوپ حاوي نمونه اضافه و 20-15 ثانيه نمونه ها را ورتکس شدند.
3) سيصد ميکروليتر Precipititation solution را به ميکروتيوپ حاوي نمونه اضافه و ده بار عمل وارونه کردن انجام داده و سپس نمونه ها را در دماي منهاي بيست درجه سانتي گراد به مدت بيست دقيقه قرار داده شدند.
4) ميکروتيوپ ها را به آرامي معکوس نموده و آب رويي را خالي نموده و رسوب براي انجام مراحل بعد مورد استفاده قرار گرفت.
5) هزار ميکروليتر بافر شستشو به ميکروتيوپ حاوي نمونه اضافه و ده بار عمل وارونه شدن انجام داده و نمونه ها را به مدت پنج دقيقه در دوران rpm1400 سانتريفيوژ گرديدند.
6) نمونه ها را به مدت پنج دقيقه در دماي شصت وپنج درجه سانتي گراد قرار داده تا کاملا” خشک شود.
7) پنجاه ميکروليتر Solvent buffer به ميکروتيوپ حاوي نمونه ها اضافه و به آهستگي آن را شيک نموده و به مدت 5 دقيقه در دماي شصت و پنج درجه سانتي گراد قرار داده شد.
8) نمونه ها به مدت سي ثانيه در دوران rpm1200 سانتريفيوژ گرديدند و محلول روئي شامل DNA خالص به منظور نگهداري آن را در ميکروتيوپ هاي 5/0 و در دماي 20- نگهداري نمود. براي شناسائي جنس باسيلول PCR براي ناحيه 16S rDNA داشته شد و از پرايمر رايج 16S rDNA استفاده گرديد. در اين روش يک قطعه چهارصد جفت بازي از ژن 16S rDNA تکثير مي شود.
3-9-1- شرايط PCR
همانطور که در جدول 3-5 نشان داده شده است آزمايش PCR در مخلوط واکنشي به حجم 50 ميکروليتر شامل 6/32 ميکروليتر ddH2O، 5 ميکروليتر 10X buffer، 4 ميکروليترMgCl2 ، 2 ميکروليترdNTP ، 1 ميکروليتر پرايمر( جدول3-4)، 5 ميکروليترTemplate ، 4/0 ميکروليترDNA polymerase tag صورت گرفت. سپس واکنش در 96 درجه سانتيگراد براي مدت 2 دقيقه (دناتورايون اوليه) و

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید