35 دور ، 1 دقيقه در 94 درجه سانتيگراد ، 1 دقيقه در 95 درجه سانتي گراد ، 1 دقيقه و 30 ثانيه در 72 درجه سانتي گراد انجام گرديد. بعد از اتمام 35 دور ، واکنش در 72 درجه سانتي گراد به مدت 5 دقيقه قرار گرفت.
جدول 3-3 توالي پرايمر طراحي شده براي 16s rDNA
Primer
Name
?’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-?’
BAc??F
?’-GACGGGCGGTGTGTA CAA-?’
Uni ????
جدول 3-4 ميزان مواد لازم جهت انجام PCR
PCR condition
??.?µl
ddH?O
? µl
??x buffer
? µl
Mg Cl?(?? mM)
?µl
dNTP
?µl
Primer
?µl
Template
?.?µl
Tag
T.V=??µl
3-9-2- تعيين توالي 118DNA
45 ميکروليتر از محصول PCR به همراه پرايمر فوروارد براي تعيين توالي جهت شناسايي مولکولي بر اساس s rRNA16 به شرکت ماکروژن کره ي جنوبي (www.macrogen.com) ارسال شدند.
3-10- آزمون توان بازدارندگي رشد عوامل بيماري زاي گياهي (قارچ هاي بيماري زا)
در اين مرحله ابتدا محيط کشت نوترينت براث و سابورود دکستروز براث جهت رشد باکتري ها و قارچ هاي تهيه شده از مرکز ذخاير ژنتيکي تهيه نموده و نمونه هاي مذکور در محيط هاي اشاره شده تلقيح گرديد و به مدت 24 ساعت در انکوباتور در دماي 37 درجه سانتي گراد نگهداري شدند. همچنين باکتري هاي اندوفيتيک جداسازي شده به مدت 24 ساعت در دماي 30 درجه سانتي گراد در گرمخانه انکوبه گرديدند. سپس سوسپانسيون باکتريايي ( اندوفيتيک ) در دور rpm8000 به مدت 15 دقيقه قرار داده و سانتريفوژ شدند. از طرف ديگر از پاتوژن ها ي گياهي کشت داده شده در محيط هاي ذکر شده در محيط نوترينت براث معادل نيم مک فارلند تهيه گرديد و پس از آن به ميزان يک لوپ برداشته و بر روي محيط کشت مولر هينتون آگار به صورت به نقطه اي در فاصله ي 0.5 سانتي متري از خط کشت باکتري کشت داديم. سپس به مدت 48-24 ساعت در دماي محيط انکوبه نموديم. بدين منظور جدايه هاي باسيلوس عليه چهار قارچ استاندارد شامل آسپرژيلوس نايجر، آلترناريا آلترناتا، فوزاريوم اکسي پوروم و موکور مورد آزمايش قرار گرفتند.
3-10-1- تهيه سوسپانسيون باکتري ها
براي تهيه ي سوسپانسيون باکتري نيز از باکتري هاي رشد يافته (کشت خالص) در محيط نوترينت براث و سابورود دکستروز براث استفاده شد.يک تا دو کلني از باکتري مورد نظر را به محيط براث که رشد ميکروارگانيسم را حمايت مي کند تلقيح شدند و به مدت 24 ساعت در دماي 30 درجه سانتي گراد در گرمخانه انکوبه گرديدند. سپس سوسپانسيون باکتريايي (اندوفيتيک) در دور rpm8000 به مدت 15 دقيقه قرار داده و سانتريفوژ شدند. پس از رشد باکتري سوسپانسيون با محيط نوترينت براث معادل نيم مک فارلند تهيه شد.
تهيه استاندارد نيم مک فارلند:
براي تهيه لوله ي استاندارد شماره نيم مک فارلند در يک لوله آزمايشگاهي بلند در پيچ دار 05/0 ميلي ليتر کلريد باريم 175/1 درصد را به 95/9 ميلي ليتر محلول اسيد سولفوريک 1 درصد مي افزاييم. کدروت حاصله معادل 5/1×10 سلول در هر ميلي متر مکعب است(cells/mm ( جهت جلوگيري از تبخير در آن را محکم مي نماييم.
جدول 3-5 استانداردهاي مک فارلند
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0.5
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.5
Barium choloride(ml)
9
9.1
9.2
9.3
9.4
9.5
9.6
9.7
9.8
9.9
9.95
Sulfuric acid(ml)
30
27
24
21
18
15
12
9
6
3
1.5
Approximatecelldensity
سوسپانسيون تهيه شده را در لوله هاي در بسته و در تاريکي به مدت 6 ماه مي توان نگه داشت و هر بار قبل از استفاده کاملا” تکان داده تا يکنواخت شود.
3-11- اثر تلقيح باکتري هاي اندوفيت روي پارامترهاي رويشي گياهان دارويي
يک گرم از بذر هاي چهار گياه داروئي نعناع فلفلي، مارچوبه و بابونه از شرکت بذر فروشي اصفهان خريداري را به مدت هشت ساعت در دو ميلي ليتر از سوسپانسيون جدايه هاي باکتري 48 ساعته وبا جمعيت معادل نيم مک فارلند تلقيح شدند و بعد از مدت هشت ساعت در گلدان هايي به وزن 2/0 کيلوئي حاوي سيصد گرم خاک کاشتيم.
3-11-1- مرحله کاشت
با توجه به طرح آزمايشي (طرح کامل تصادفي با شش سطح باکتري و سه شاهد با سه تکرار) مقدار يک گرم از بذور را در عمق 5/0 سانتي متر ريخته و مقدار کمي خاک روي آنها ريخته و با توجه به توصيه شرکت دهنده بذر مقدار کمي آب شهر (1 ميلي ليتر) روي آنها ريخته شد. لازم به ذکر است که در تيمارهاي آزمايشي حاوي باکتري هر گرم بذور با 2 ميلي ليتر سوسپانسيون باکتري 24 ساعت رشد کرده تلقيح شدند. در تيمار شاهد هر گرم بذر با 2 ميلي ليتر آب شهري تلقيح شدند.
3-11-2- مرحله ي داشت و تنک کردن
به تمامي گلدان ها در روز هاي اوليه معادل دو ميلي ليتر و در روز هاي بعدي معادل چهار تا پنج ميلي ليتر آب شهري مي داديم.
گياه مارچوبه بعد از گذشت زمان 8-7 روز از مرحله ي کاشت جوانه زد و بعد از گذشت 3-2 روز از جوانه زدن و اطمينان از رشد گياه به يک عدد در هر گلدان رسانده شد. هر گلدان به ميزان 2 تا 3 ميلي ليتر آب شهر روزانه آبياري شدند.
گياه نعناع بعد از گذشت 45-40 روز شروع به جوانه زدن نمود و مراحل بالا براي اين گياه نيز انجام شد.
گياه بابونه نيز بعد از گذشت زمان 7-6 روز از مرحله ي کاشت جوانه زد و مراحل بالا را عينا” براي آن انجام شد.
3-12- اندازه گيري رشد طولي گياه
بعد از مرحله ي تنک کردن و اطمينان از رشد گياه جدولي تنظيم و با خط کش رشد طولي گياه براي همه ي تيمارهاي آزمايشي اندازه گيري شد.
فصل چهارم
نتايج و بحث
4-1- جداسازي باکتري هاي اندوفيت از ريشه گياهان دارويي:
يکي از چالش هاي عمده در قرن 21 داشتن محيط خوب و کشاورزي سازگار با محيط زيست مخصوصا در زمينه توليد محصول است.اين امر در واقع پايه ي مهمي براي تغذيه جمعيت انساني رو به فزوني در روي زمين است. از طرف ديگر ناگواري هايي هم با خود به همراه دارد که مي توان به منابع طبيعي محدود نيتروژن، فسفر و ساير عناصر خاک که براي رشد و عملکرد گياه مهم مي باشند اشاره نمود. علاوه براين آفت کش ها و کودهاي شيميايي به مقدار زياد و نامناسب در متد هاي کشت گياهان بکار برده مي شوند که مشکلاتي چون سلامتي، بهداشتي و محيطي را بوجود مي آورد در اين مورد تلقيح ميکروبي مي تواند يک جايگزين مناسب و کاربردي براي حفظ محيط زيست و سلامتي انسان باشد. اين محصولات ميکروبي علاوه بر قارچ هاي ميکوريزايي وميکروارگانيسم هاي خاک، باکتري ها و قارچ هاي اندوفيتيک مي باشند که در ريشه ها، برگ ها و دانه ها زندگي مي کنند. گاهي اين ميکروارگانيسم ها مي توانند بعنوان عوامل بيوکنترل در برابر پاتوژن ها و بهبود باروري و توسعه گياهان بدون هيچ آسيب محيطي عمل نمايند.اندوفيت ها مي توانند متابوليت هاي ثانويه، آنزيم هاي خارج سلولي، هورمون هاي گياهي مشابه و موادي که اجزاي بيوشيميايي را در تعامل مثبت با گياهان فعال مي کند را توليد نمايند همچنين اندوفيت ها نقش مهمي در حمايت از ميزبان خود در برابر پاتوژن ها نيز دارا مي باشند اين ميکروارگانيسم ها منبع جديدي از ترکيبات فعال زيستي وشيميايي با پتانسيلي بالقوه براي بهره برداري در طيف گسترده اي از پزشکي، کشاورزي و عرصه هاي صنعتي مي باشند که نسبتا مطالعات کمي روي آنها صورت گرفته است . گياهان تيره نعناع طوري درکره زمين پراکنده شده اند که در اغلب نواحي يافت مي شوند. امروزه در کشورهاي مختلف جهان، متجاوز از يک هزار تن اسانس در سال از اين گياهان تهيه مي شودو اين خود درجه اهميت و توسعه کشت آنها را در نقاط مختلف کره زمين نشان مي دهد.در حال حاضر در ايران از اسانس نعناع در ساخت داروهاي گياهي زيادي استفاده مي شود.مارچوبه نيز به صورت وحشي در اکثر نقاط دنيا مي رويد. از نظر طب قديم ايران مارچوبه گرم و خشک است و سرشار از منيزيم، نياسين، فسفر، پتاسيم، ريبوفلاوين، سلنيوم، روي و فيبر مي باشد. بدين ترتيب براي افزايش توليد اسانس در اين گياهان مي توان از باکتري هاي اندوفيت کمک گرفت .
باکتري هاي اندوفيتيک تقريبا در همه ي گياهان مطالعه شده يافت شده اند و گزارشات زيادي در رابطه با باکتري هاي اندوفيتيک و گياهاني که در آنها ساکن اند شامل برنج، موز، گندم، چقندر قند، هويج، سويا، سيب زميني، ليمو، گوجه فرنگي و غيره داده شده است.در اين مطالع نيز از 3 گياه انتخابي ( مارچوبه ، نعناع فلفلي و بابونه) 6 جدايه اندوفيتي جداسازي شدند.
پس از 24 ساعت انکوباسيون محيط کشت هاي نوترينت آگار و پپتون سويا آگار از نظر نوع و تعداد کلني مورد بررسي قرار گرفتند که براي هر گياه دو نوع کلني مشاهده شد که از هر نوع کلني براي بررسي نوع گرم آن لامي تهيه گرديد و رنگ آميزي گرم صورت گرفت و نتايج همه ي جدايه را در گروه گرم مثبت ها قرار داد.
N1 B2 N2
B1 M2 M1
شکل 4-1 رنگ آميزي گرم اندوفيت ها
4-2- نتايج تست هاي بيوشيميايي
براي تمامي کلني هاي بدست آمده از مراحل قبل تست هاي بيوشيميايي زير اعمال شد و نتايج آن در جدول ثبت گرديد .
جدول 4-1 ويژگي هاي بيوشيميايي سويه هاي بدست آمده
B2
B1
N2
N1
M2
M1
TesT

+
+

_
+

+

+

+
+

+
+


+
+

+
+

+

+

+
+

+
+

+
+
+

+
+

+

+

+
+

+
+


+
+

+
+

+

+

+
+

+
+

+



+
+
+
+
+
+

+


+
+

+
+
+

+
+

+

+

+
+

+
+

Citrate utilization
V-P
Nitrate reduction
Indole
Growth is salt 7%
Starch hydrolysis
Urease
Glucose
Monnitol
Moltivity
H2S production
Catalase test
Hemolysis blood Agar
Acid and gas from glucose
Casein hydroltsis
Gelatin hydrolysis
Growth in 65C
ّ
شکل 4-2 کشت اندوفيت ها در محيط کشت api20E
شکل 4-3 کشت اندوفيت ها در SIM و بررسي حرکت آنها
B1 N1 N2 B2
شکل 4-4 کشت اندوفيت ها روي Blood agar و بررسي هموليز آنها
4-3- تعيين توالي محصولات نهايي PCR
45 ميکروليتر از محصول PCR به همراه پرايمر فوروارد براي تعيين توالي جهت شناسائي مولکولي بر اساس 16S rDNA به شرکت ماکروژن (www.macrogen.com)کره جنوبي ارسال شدند.
4-3-1- نتايج حاصل از سکوئنسينگ ژن 16S rDNA باکتري
سکانس هاي حاصل از تعيين توالي با استفاده از نرم افزار Blast با توالي هاي موجود در بانک ژني مرکز ملي اطلاعات بيوتکنولوژي (www.ncbi.nlm.nih.gov) مقايسه شدند. اين کار جهت شناسائي ايزوله ها به روش مولکولي و با استفاده از توالي 16S rDNA موجود در سطح جنس و گونه انجام گرفت.
شکل 4-5 تعيين توالي نمونه M1- پرايمر Rev
شکل 4-6 همولوژي 97% نمونه M1 – پرايمر Rev با
Bacillus cereus strain KU4 16s ribosomal RNA gene , partial sequence
شکل 4-7 تعيين توالي نمونه M2 – پرايمر Rev
شکل 4-8 همولوژي 97% نمونه M2 –

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید