رقم از آن شناسايي شده که هر يک بخوبي با شرايط خاص جوي محل خود از قبيل گرم وخشک، کويري و سرد و خشک و رشد در اراضي با غلظت املاح بالا خو گرفته است(2).
شکل 2-22-گياه گلرنگ
اين گياه از جمله گياهان داروويي است و گلچه آن نه تنها در پزشکي بلکه در غذا به عنوان چاشني و رنگ بکار مي رود و از جمله افزودني به نوشيدني هاست(11). در طب سنتي نيز کاربردهاي زيادي براي قسمت هاي مختلف آن ذکر شده است از جمله به خاصيت دم کرده برگ ها و گلچه هاي آن در پايين آورندگي چربيهاي خون (26) و کاربرد عصاره آبي گلچه هاي آن به عنوان ملين و ضد التهاب و مسکن مي توان اشاره کرد(86).
فصل سوم: مواد و روش ها
در اين تحقيق از تجهيزات مختلفي استفاده شده که در جدول 3-1 به آنها اشاره شده است.
جدول 3-1 تجهيزات مورد استفاده
نام تجهيزات
نام تجاري
ترازوي ديجيتالي
KERN 470 آلمان
تغليظ کننده چرخان
Heidolph
پارافيلم
Laboratory film Pm-996
اسپکتروفتومتر
Biochrom انگلستان
گرمخانه يخچال دار
Memmert
حمام آب
LAUDA
سانتريفوژ
SIGMA & Herolab آلمان
پمپ خلأ
Heidolph
آون تحت خلأ
BINDER
آون جريان همرفت
of-02
مولد امواج فراصوت
dr. Hilscher
نمونهگير
Orange Scientific
الک مش 100
ساخت ايران
آسياب صنعتي
توس شکن خراسان
PH متر
JENWAY 3020
رنسيمت
743Metrohm
3-1- مواد
مواد اوليه مورد استفاده در اين پژوهش عبارتند از:
3-1-1- گياه گلرنگ
گياه گلرنگ (Carthamus tinctorious L) در ارديبهشت ماه 1390 جمعآوري شد.
جدول 3-2- مواد مصرفي
ماده مصرفي
شرکت سازنده
ساخت
معرف دي فنيل پيکريل هيدرازين
سيگما
آمريکا
آب مقطر دوبارتقطير

ايران
معرف فولين سيوکالتيو
مرک
آلمان
آمونياک
مرک
آلمان
روغن سويا خالص و بوگيري شده عاري از آنتي اکسيدان
کارخانه سه گل نيشابور
ايران
(نيشابور)
کربنات سديم
Applichem
ايران
گاليک اسيد
Sigma
پروپيلن گلايکول

ايران
متانول
دکترمجللي
ايران
3-2- روش ها
3-2-1- آمادهسازي نمونه گياهي مورد نياز
برگهاي گياه گلرنگ پس از جمع آوري در دماي اتاق و دور از نور خورشيد به طور کامل خشک و سپس توسط آسياب برقي پودر و از الکي با مش 100 عبور داده شده و در محلي تاريک، سرد و خشک نگهداري شدند.
شکل 3-1 بوته گلرنگ
شکل 3-2 برگ گلرنگ خشک شده
3-2-2- استخراج ترکيبات آنتياکسيداني
جهت تهيه عصاره از برگ و گلهاي گياه از روش غرقابي و روش استخراج با دستگاه اولتراسوند، استفاده شد. حلال مورد استفاده در هر دو روش متانول 80 درصد بود. متانول به عنوان حلال مؤثر به طور گسترده براي استخراج ترکيبات آنتياکسيداني از منابع گياهي مورد استفاده قرار ميگيرد.
3-2-2-1- روش ماسراسيون
5 گرم نمونه پودر شده گياهي با 175 ميلي ليتر متانول 80 درصد ( نسبت 1:35 حجمي/وزني ) طي مدت 24 ساعت بوسيله دستگاه Shaker و در دماي محيط مخلوط شد. مخلوط بدست آمده با کاغذ واتمن شماره يک صاف گرديد و عصاره صاف شده از اين مرحله در دماي 5-2 درجه سانتيگراد براي حفظ ترکيبات فنوليک در يخچال نگهداري شد. در مرحله بعدي پودر گل گلرنگ عصاره گيري شده در در مرحله اول وزن گرديد و به نسبت ( 10_1 حجمي/وزني ) با حلال تازه ( متانول 80 درصد ) توسط دستگاه در دماي محيط به مدت 24 ساعت مخلوط گرديد. مخلوط بدست آمده از مرحله دوم نيز همانند مرحله اول با کاغذ واتمن شماره يک صاف گرديد و عصاره حاصل از مرحله دوم به عصاره حاصل از مرحله اول اضافه شد و در ادامه در دماي 38 درجه سانتيگراد با دستگاه روتاري تغليظ و سپس در آون تحت خلاء و در همان دما تا رسيدن به وزن ثابت خشک شد(8).
3-2-2-2- استخراج با اولتراسوند
در فرآيند استخراج با اولتراسوند، با هدف بهينهسازي شرايط استخراج فاکتورهاي مؤثر در استخراج نظير: دما، زمان و pH در سطوح مختلف مورد بررسي قرار گرفتند.
3-2-2-2-1- نحوه تعيين سطوح pH
pH حلال مورد نظر، (متانول80 درصد) برابر با 3/5= pH در دماي آزمايشگاه (?C 21) بود. با اضافه کردن 1 گرم ازپودر نمونه گياهي، بعداز هم زدن مخلوط حاصل، pH در حد 6 ثابت شد. از سوي ديگرخصوصيات آمفوتري که در مخلوط پودر گياه و حلال وجود دارد، باعث ميشود که بعد از اضافه کردن حجمهاي کم از محلولهاي بازي و اسيدي ضعيف شده، با همزدن نمونه، بازگشت pH به سمت pH طبيعي مشاهده شود. همچنين حجمي از محلولهاي آمونياک 1 نرمال که به 35 ميلي ليتر از مخلوط حلال و نمونه اضافه ميشوند بايد باعث تغيير محسوس در حجم نهايي شوند. در نتيجه، حجم 100 و 200 ماکروليتر از آمونياک 1 نرمال به ترتيب براي اعمال pH 7 و 8 استفاده شد.
در نهايت، چون pH 8 به عنوان سطح بالاي pH و pH برابر 6 به عنوان سطح مرکزي درنظرگرفته شد، pH برابر 7توسط نرم افزار Minitab به عنوان سطح پايين pH تعيين شد.
ميزان نمونه به حلال، با توجه به استفاده از Sonotrode، مدل S2 قطر mm1 و حداکثر دامنه نوسان (Amplitude) برابر با 260 ميکرومتر، محدوديت استفاده حجمي بين CC50-2 وجود دارد، به همين خاطر حلال در يک نسبت ثابت 1:35 به 1گرم پودر گياه اضافه ميشود (2). دما در سه سطح (?C 45، ?C 30 و ?C 15) انجام شد. زمان در سه بازه( 5،20 و 35 دقيقه) انجام شد.
بر اساس طرح RSM، مدل Box-Behnken جهت کسب حداکثر اطلاعات، با انجام حداقل آزمايشات براي بررسي 3 فاکتور در سه سطح انتخاب شد و بر اساس 19 آزمون جهت بررسي روند ميزان استخراج و تعيين شرايط بهينه انجام شد.
بعد از اضافه کردن حلال در صورتي که آمونياک و اسيد کلريدريک 1 نرمال اضافه شود، همزدن تا زماني که pH ثابت شود ادامه مييابد، سپس سطح بشر حاوي نمونه و حلال با پارافيلم پوشانده شد تا در حين فرآيند التراسوند، تبخير متانول آن از بشر تا حد امکان کاهش يابد.
بعد از پايان تيمار التراسوند، نمونه در داخل سلهاي سانتريفوژ قرار گرفت و در سرعت rpm10000 و در دماي محيط به مدت 30 دقيقه، سانتريفوژ شد. بعد از پايان سانتريفوژ، قسمت بالاي مخلوط درون سلها که شفاف است، با Sampler جدا شد و در دماي C? 35 درون Rotary evaporatore تغليظ شد و در آون تحت خلأ، در شرايطي مشابه روش غرقابي، عصاره خشک شد.
جدول 3-3 _تيمارهاي طراحي شده در آزمون سطح پاسخ بر اساس مدل باکس بنکن در 3 فاکتور در سه سطح
شکل 3-3 نمونه تحت تاثير امواج اولتراسوند
شکل 3-4 مرحله سانتريفوژ
شکل 3-5 حذف حلال توسط دستگاه تبخير گردان تحت خلا
شکل 3-6 حذف نهايي حلال توسط آون تحت خلآ
3-3- آزمونهاي شيميايي
3-3-1- اندازهگيري مقدار کل ترکيبات فنوليک
مقدار کل ترکيبات فنوليک در عصاره حاصل از دو روش استخراج غرقابي و التراسوند، بر اساس روش فولين سيوکالتيو مورد بررسي قرار گرفت(33). براي تهيه محلولي از پودر عصاره خشک شده با غلظت ppm1000 در بالون 100 ميلي ليتر، و به 100 ميليگرم از پودر عصاره خشک شده متانول 80 درصد اضافه شد تا به حجم 100 ميليليتر برسد. سپس بالون روي Heater Magnetic قرار داده شد تا پودر عصاره به طور کامل در متانول حل شود.
براي آزمون فولين، عصارههاي تهيه شده، 100 ميکروليتر از محلول عصاره ppm1000 در لوله آزمايش ريخته شد و سپس 500 ميکروليتر از محلول رقيق شده، معرف فولين سيوکالتيو به نسبت (10/1) اضافه شد. بعد از فاصله زماني 1 دقيقه، در دماي اتاق 5/1 ميلي ليتراز کربنات سديم 20 درصد اضافه شد.
و تا حد کافي عمل همزدن انجام گرديد. ترکيب درون لوله آمايش به مدت 2 ساعت در تاريکي در دماي اتاق نگهداري شد و سپس جذب محلول در طول موج 760 نانومتر، در اسپکترفتومتر خوانده شد. آب مقطر به عنوان شاهد استفاده شد.
مقدار کل ترکيبات فنوليک از روي معادله خط رسم شده بر مبناي اسيد گاليک به صورت mg گاليک اسيد بر گرم عصاره خشک شده بيان گرديد. آزمون فولين، با سه تکرار انجام شد.
3-3-2- رسم منحني استاندارد براي رابطه جذب و غلظت اسيد گاليک
محلولهاي استاندارد در غلظتهاي مختلف اسيد گاليك (0، 30، 70، 110، 150، 190 و ppm220 در متانول 80درصد) تهيه شد. 100 ميکروليتراز هريك از محلولها را در لوله آزمايش وارد كرده و ساير مراحل را بر اساس قسمت قبلي انجام شد. آزمون جذب براي هريك از محلولهاي استاندارد در سه تكرار انجام شد. بر اساس نتايج جذب خوانده شده منحني جذب اسيد گاليك با توجه به غلظتهاي ساخته شده رسم شد و سپس مقدار كل تركيبات فنوليك براي هر يك از عصارهها، بر اساس معادله خط منحني جذب اسيد گاليك محاسبه شد.
3-3-3- تعيين فعاليت آنتيراديكالي
تعيين فعاليت آنتي راديكالي از طريق آزمون DPPH و به وسيله معرف 2و2-دي فنيل پيكريل هيدرازين انجام ميشود (71) حجمهاي بين 1000- 100ميکروليتر از عصاره متانولي در رقت ppm200 (cc100/gr020/0) درون لوله آزمايش مي ريزيم و بر اساس حجم عصاره اضافه شده، متانول 80 درصد به آن اضافه مي كنيم تا در كل حجم درون لوله آزمايش كه شامل عصاره و متانول 80 درصد مي باشد به 4 ميلي ليتر برسد سپس به آن 1000 ميکروليتر محلول 2و2- دي فنيل پيکريل هيدرازيل124، ppm120 اضافه شد (ميکروليتر 100/gr012/0) و سپس به مدت 30 ثانيه عمل همزدن را انجام شد. محلول حاصل را در تاريكي و در دماي اتاق به مدت 115 دقيقه نگهداري ميكنيم و سپس جذب نمونه را در 517 نانومتر در دستگاه اسپكتروفتومتر Shimadzu گزارش مي كنيم. دستگاه با متانول 80 درصد كاليبره مي شود نمونه شاهد كه حاوي 4 ميلي ليتر متانول و cc1، ppm DPPH120 ميباشد نيز بعد از 115 دقيقه، جذب آن گزارش مي شود.
فعاليت آنتي راديكالي با استفاده از رابطه ي زير محاسبه مي شود:
Abbsobance of control – Abbsorbance of sample
DPPH Scavenging= %
Abbsorbance of control
نتايج به صورت IC50 گزارش مي شود. IC50، غلظتي از عصاره است که ميزان راديکال هاي آزاد DPPH را به نصف کاهش دهد و به عبارت ديگر، IC50 غلظتي از عصاره است ميزان جذب نمونه شاهد را که شامل DPPH است به نصف کاهش دهد. BHA به عنوان کنترل مثبت براي آزمون DPPH در نظر گرفته شد.
3-3-4-آزمون رنسيمت:
به منظور پايداري اکسايش روغن از دستگاه رنسيمت ( Metrohm 743 ) استفاده شد. در اين روش از شرايط تشديد‌شده اکسايش مانند دماي بالا و جريان هوا استفاده مي‌شود. اکسايش نمونه‌ها در ظروف مخصوص و در محفظه مجهز به گرم‌کن انجام مي‌شود. در اين حال جرياني از هوا از محل واکنش اکسايش به ظرف محتوي آب هدايت و ضريب هدايت الکتريکي آب بر حسب ميکروزيمنس بر سانتيمتر ( s/cm? ) محاسبه مي‌گردد. افزايش هدايت الکتريکي آب به عنوان شاخصي از پيشرفت اکسايش در نظر گرفته مي شود. آزمون رنسيمت با تهيه غلظت ثابتي از عصاره در روغن سوياي تصفيه بوگيري و رنگبري شده بدون آنتي‌اکسيدان ، تهيه و 4 گرم از نمونه آماده شده به درون لوله‌هاي مخصوص دستگاه منتقل شد. پس از آن لوله‌ها در دماي 110 درجه سانتي گراد و با شدت جريان هواي 20 ليتر بر ساعت ، درون دستگاه قرار گرفتند. زمان لازم ، بر حسب ساعت ، براي رسيدن روغن به شرايط اکسيد شده

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید